Η ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΕΜΒOΛΙΩΝ

Η ανάπτυξη ενός αποτελεσματικού εμβολίου αποτελεί μια πολυσταδιακή διαδικασία που περιλαμβάνει την ενσωμάτωση ενός ή περισσότερων στελεχών μικροοργανισμών σε ένα συγκεκριμένο φορέα μαζί με συνδετικούς παράγοντες και / ή άλλα πρόσθετα, που εξασφαλίζουν την προστασία των κυττάρων κατά την αποθήκευση και τη μεταφορά. Επειδή τα εμβόλια αποθηκεύονται συχνά σε μη-βέλτιστες συνθήκες (π.χ., υψηλή θερμοκρασία, έκθεση στο φως), θα πρέπει να έχουν μια εκτεταμένη διάρκεια αποθήκευσης, δηλαδή οι μικροοργανισμοί πρέπει να είναι βιώσιμοι και να έχουν την ικανότητα να επιβιώνουν σε αντίξοες συνθήκες. Το καλό σκεύασμα πρέπει επίσης να εξασφαλίσει την αποτελεσματική ενσωμάτωση των μικροοργανισμών στο έδαφος και να ενισχύσει τη δραστηριότητά τους, προκειμένου να μεγιστοποιηθούν τα οφέλη από τον εμβολιασμό των φυτών ξενιστών. Για να υιοθετηθεί εύκολα από τους αγρότες, το εμβόλιο πρέπει να είναι οικονομικό και εύκολο στο χειρισμό και χρήση, για να εξασφαλίσει ότι οι μικροοργανισμοί θα προμηθεύονται με τον πιο κατάλληλο τρόπο και μορφή. Η παρασκευή του σκευάσματος είναι ένα κρίσιμο ζήτημα, αλλά δυστυχώς έχει διεξαχθεί περιορισμένος αριθμός μελετών πάνω στο θέμα αυτό. Τα διαθέσιμα στοιχεία δείχνουν ότι από τη δεκαετία του ‘80 του περασμένου αιώνα, οι περισσότερες έρευνες πάνω στα Rhizobia επικεντρώνονται στην βακτηριακή γονιδιωματική και φυσιολογία και λιγότερο από 1% πάνω στις πτυχές των σκευασμάτων των εμβολίων. Σε κάθε περίπτωση, υπάρχει πραγματική ανάγκη βελτίωσης των εμβολίων για να είναι δυνατή η συνέχιση της αποτελεσματικής ανάπτυξης και της εμπορευματοποίησης των νέων βιολιπασμάτων που να είναι πιο επιτυχή, πιο σταθερά με την πάροδο του χρόνου, με καλύτερη ποιότητα και να πληρούν όλες τις άλλες γεωργικές ανάγκες .

Ένα ιδανικό σκεύασμα δεν υπάρχει και προφανώς κάθε είδους βιολίπασμα έχει τα δικά του πλεονεκτήματα και περιορισμούς. Ωστόσο, υπάρχουν κάποια κρίσιμα βήματα που πρέπει να ληφθούν πλήρως υπόψη κατά την παραγωγή βιολιπασμάτων. Η επιλογή που γίνεται σε αυτά τα βήματα μπορεί να προδικάσει την επιτυχία ή την αποτυχία του εμβολιασμού. Η επιλογή των μικροοργανισμών που πρέπει να εμβολιαστούν είναι ζωτικής σημασίας. Μερικά από τα πιο σημαντικά επιθυμητά χαρακτηριστικά του στελέχους του εμβολίου (βακτηριακό ή μυκητιασικό) περιλαμβάνουν τη γενετική σταθερότητά του, την ικανότητά του να είναι χρήσιμο για τις καλλιέργειες στοχους, να είναι ανταγωνιστικό με τους φυσικούς μικροβιακούς πληθυσμούς, να μεταναστεύει από την θέση του εμβολιασμού στο φυτό ξενιστή και να είναι ικανό να επιβιώσει κάτω από αντίξοες συνθήκες στο έδαφος χωρίς την παρουσία του ξενιστή. Άλλα σημαντικά χαρακτηριστικά που έχουν ιδιαίτερη σημασία κατά τη διάρκεια της παραγωγής είναι η δυνατότητα του στελέχους να καλλιεργείται σε συνθήκες εργαστηρίου (με εξαίρεση των ΔΜΜ, οι οποίοι δεν μπορεί να αναπτυχθούν χωρίς ένα φυτό ξενιστή), την ικανότητα να αναπτύσσεται ή να επιβιώνει σε φορείς (κατα τον χρόνο συγκέντρωσης ή αποθήκευσης), πάνω στους σπόρους και στο έδαφος, καθώς και να είναι συμβατός με τα αγροχημικά προϊόντα που ενδεχομένως θα χρησιμοποιηθούν στις καλλιέργειες. Το ζώντανό εμβόλιο πρέπει επίσης να είναι σε θέση να ξεπεράσει τις διάφορες τεχνολογικές διαδικασίες κατά τη διάρκεια της παραγωγής και να διατηρήσει τις λειτουργικές ιδιότητες του. Τα βακτηριακά εμβόλια τυπικώς καλλιεργούνται σε υγρό μέσο για την επίτευξη υψηλών αποδόσεων από τη βιομάζα. Η σύνθεση του μέσου και οι συνθήκες ανάπτυξης (θερμοκρασία, ρΗ, ανάδευση, εξαερισμός, κ.λπ.) έχουν άμεση σχέση με τις φυσιολογικές-βιοχημικές ιδιότητες του συγκεκριμένου στελέχους και τον τύπο του εμβολίου, το οποίο θα παράγεται. Οι προκύπτοντες βακτηριακές καλλιέργειες χρησιμοποιούνται για τον εμβολιασμό διαφόρων φορέων (ενθυλάκωση ή εμποτισμός τύρφης και κόκκων) είτε για την παρασκευή δραστικών υγρών σκευασμάτων μετά την προσθήκη των κατάλληλων προσθέτων. Η μεγάλης κλίμακας παραγωγή ομοιογενών βακτηριακών καλλιεργειών σε βιοαντιδραστήρες είναι μια ευρέως διαδεδομένη πρακτική (Εικ.2).

Εικ.2. Μαζική παραγωγή Azolla

Μόλις επιλεχθεί το ειδικό στέλεχος / στελέχη για το εμβόλιου μπορεί να προσδιοριστεί μια τυποποιημένη διαδικασία παρασκευής. Ωστόσο, για τα βιολιπάσματα, σε αντίθεση με τα βιοφυτοφάρμακα, το κόστος παραγωγής είναι ένα σημαντικό εμπόδιο. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η τιμή των βιολιπασμάτων δεν πρέπει να είναι μεγαλύτερη από εκείνη των συμβατικών λιπασμάτων. Ως εκ τούτου, ως μέσο ανάπτυξης για τα PGPR, πρέπει να χρησιμοποιούνται φθηνές πρώτες ύλες (π.χ.. ορός γάλακτος, ιδατικά ιζήματα, κοπρόχωμα και άλλα.). Μια άλλη προσέγγιση για τη μείωση του κόστους παραγωγής είναι η χρήση αγροτο-βιομηχανικών υπολειμμάτων, εμπλουτισμένων με φυσικά φωσφορικά. Κατά τη διάρκεια της λιπασματοποίησης ή τςη ζύμωσης, οι ελεύθεροι ή ακινητοποιημένοι μικροοργανισμοί οι οποίοι παράγουν οργανικά οξέα, προστίθενται στο πλέγμα, βελτιώνοντας τη διαλυτότητα του φωσφορικού και με αυττον τρόπο αυξανουν την πρόσβασή του στα φυτά.

Πρόσφατα, η χρήση βιομεμβρανών επίσης εφαρμόστηκε ως ένα πιθανό μέσο για την παραγωγή αποτελεσματικών της ενοφθαλμισμάτων. Οι βιομεμβράνες αποτελείται από μικροβιακά κύτταρα, ενσωματωμένα σε ένα πολυμερές πλέγμα (επίσης γνωστό ως εξωκυτταρική πολυμερής ουσία ΕΠΟ) και προσκολλημένα σε μια αδρανή ή ζωντανή επιφάνεια η οποία παρέχει δομή και προστασία της βακτηριακής καλλιέργειας. Παρατηρούνται τρεις κύριοι τύποι βιοφίλμ στο έδαφος: βακτηριακά (συμπεριλαμβανομένων των Actinomycetes), μυκητιακά και μυκητιασικά-βακτηριακα. Τόσο οι βακτηριακές όσο και οι μυκητιασικές βιομεμβράνες σχηματίζονται σε αβιοτικές επιφάνειες. Οι αποικίες μυκήτων παίζουν το ρόλο της βιοτικής επιφάνειας κατά τον σχηματισμό των μυκητιασικών-βακτηριακών βιοφίλμ. Η πλειοψηφία των βακτηρίων που υπάρχουν στα ρίζες και το έδαφος, σχηματίζουν βιοφίλμ. Ως εκ τούτου, η εφαρμογή των στελεχών PGPR που σχηματίζουν βιοφίλμ μπορεί να είναι μια επιτυχημένη στρατηγική για την ανάπτυξη και την παραγωγή βιολιπασμάτων. Ενώ οι εκτομυκορριζικοί μύκητες μπορούν να παραχθούν κατά τη ζύμωση, η καλλιέργεια των εμβολιαστών από δεονδροειδή μυκορριζικούς μύκητες είναι πολύ πιο δύσκολη λόγω της ανάγκης για φυτό ξενιστή. Οι πρώτες προσπάθειες για την παραγωγή ΔΜΜ βασίζονται σε φυτά σε γλάστρες με μείγματα χωμάτων η σε αεροπονία. Με την ανάπτυξη των μονοξενικών καλλιεργειών στα τέλη της δεκαετίας του ‘80, έγινε δυνατή η παραγωγή ΔΜΜ υπό αυστηρά ελεγχόμενες συνθήκες. Έχουν αναπτυχθεί μέθοδοι για την παρασκευή σπορίων με τη χρήση συν-καλλιέργειας τρυβλίων Petri (split-plate) και μέσω μετασχηματισμένων ριζών καρότου με Ri πλασμιδιακό DNA του Agrobacterium. Η μέθοδος επιτρέπει την παραγωγή κατά μέσο όρο 15 000 σπορίων ανά τριβλίο petri για μια περίοδο 4-5 μηνών μετά την έναρξη του κύκλου παραγωγής. Ωστόσο, αυτή χρησιμοποιείται κυρίως για φυσιολογικές και εργαστηριακές δοκιμές. Βελτιώσεις αυτής της μεθόδου έχουν επιτευχθεί μέσω της περιοδικής αλλαγής του περιβάλλοντος στο περιφερικό διαμέρισμα κάθε δεύτερο μήνα με παράλληλο συμπλήρωμα γλυκόζης στο εγγύ διαμέρισμα. Τα αποτελέσματα οδηγούν στην παραγωγή περίπου 65.000 σπορίων μετά από επτά μήνες. Ωστόσο, αυτές οι μέθοδοι χρησιμοποιούνται κυρίως για την πειραματική παραγωγή σπορίων ή για τη συντήρηση των τραπεζών γονιδίων. Ο λόγος είναι ότι το μέσο ετήσιο κόστος παραγωγής ενός σπορίου φτάνει τα 30-50 δολάρια ΗΠΑ, ανάλογα με τη μέθοδο που χρησιμοποιείται. Μεγάλης κλίμακας παραγωγή in vitro των μυκορριζικών μυκήτων, κατάλληλη για εφαρμογή σε εμπορική κλίμακα, αναπτύχθηκε πρόσφατα. Η μέθοδος βασίζεται σε μερικούς βασικούς παράγοντες: επιλογή των κατάλληλων μετασχηματισμένων ριζών καρότων με Ri πλασμίδιακό DNA του Agrobacterium για διάφορα είδη ΔΜΜ, επιλογή και διατήρηση ενός βέλτιστου περιβάλλοντος για την ανάπτυξη και την εφαρμογή διαδικασιών για τη διασφάλιση της ποιότητας.

Ωστόσο, εμπορικά εμβόλια που περιέχουν είδη ΔΜΜ εξακολουθούν να παράγοται κυρίως μέσω ανάπτυξης σε φυτά ξενιστές κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες, με την προσθήκη διαφόρων μυκητικών δομών (σπόρια, μυκήλιο) και περιέχουν υπολείμματα μυκορριζικών ρίζών φυτών τα οποία χρησιμοποιούνται ως υλικό πολλαπλασιασμού (όπως για παράδειγμα σόργο, καλαμπόκι, κρεμμύδι, ή Plantagolanceolata) (Εικ. 3). Αυτό μπορεί να θεωρηθεί ως μια κλασική μέθοδο στην οποία υποστρώματα άμμου / εδάφους ή / και άλλων υλικών (π.χ.. Ζεόλιθος, περλίτης) χρησιμοποιούνται για την μαζική παραγωγή εμβολίου δενδροειδών μυκόριζικών μυκήτων σε γλάστρες, σακούλες ή κοίτες για εφαρμογές μεγάλης κλίμακας. Τα κρίσιμα στοιχεία αυτής της στρατηγικής παραγωγής είναι:

1. χρησιμοποίηση γνωστών ειδών ΔΜΜ
2. Επιλογή βραχύβιων ξενιστών, με επαρκώς αναπτυγμένο ριζικό σύστημα, υψηλό επίπεδο αποικισμού με ένα ευρύ φάσμα δενδροειδών μυκορριζικών μυκήτων και ανοχή σε σχετικά χαμηλά επίπεδα του φωσφόρου,
3. έλεγχος της στάθμης των ορυκτών προσθέτων στο έδαφος,
4. κατάλληλος συνδυασμός των ειδών ΔΜΜ και των φυτών ξενιστών.

Με την τεχνική αυτή είναι δυνατόν να επιτευχθεί μια πυκνότητα του εμβολίου των 80-100 χιλιάδων σπορίων ανα λίτρο, που είναι ικανά να βλαστήσουν. Αυτό συνεπάγεται την ανάγκη για αραίωση του ενοφθαλμίσματος με έναν φορέα για την παρασκευή ενός εμπορικού προϊόντος.

Εικ.3. Οζίδια ρίζας Plantago lanceolate

Δεδομένου ότι οι μικροβιακές συσχετίσεις μεταξύ βακτηριακών και μυκορριζικών μυκήτων που βρίσκονται φυσικά στο χώμα, μπορούν να διεγείρουν τη συμβιωτική με τα φυτικά είδη, είναι πιθανό ότι σχηματισμοί οι οποίοι περιλαμβάνουν δύο ή περισσότερα διαφορετικά PGPR θα μπορούσαν να ενισχύσουν τις ευεργετικές επιδράσεις στα φυτά. Μικροβιακές κοινοπραξίες μπορούν να διεγείρουν την ανάπτυξη των φυτών ενός συνόλου μηχανισμών που βελτιώνουν την απορρόφηση των θρεπτικών ουσιών και αναστέλλουν τους παθογόνους μύκητες. Οι διαφορετικοί μηχανισμοί που προτείνονται για να εξηγήσουν αυτή την τόνωση της ανάπτυξης, βασίζονται στην αυξημένη ταχύτητα κυκλοφορίας των θρεπτικών ουσιών. Η τελευταία οφείλεται στην υψηλή περιεκτικότητα σε μικροοργανισμούς και την πλούσια βιοποικιλότητα στο έδαφος. Ο ταυτόχρονος εμβολιασμός με διαφορετικά PGPR ή / και ΔΜΜ συχνά καταλήγει σε αυξημένη ανάπτυξη και απόδοση, σε σύγκριση με τον εμβολιασμό με ένα είδος, ιδιαίτερα μέσω της βελτίωσης της απορρόφησης των θρεπτικών ουσιών. Πράγματι, η αλληλεπίδραση μεταξύ των βακτηρίων και των δενδροειδών μυκορριζικών μυκήτων έχει θετική επίδραση στην απορρόφηση των θρεπτικών συστατικών, ειδικά όταν τα PGPR και τα αζωτοδεσμευτικά βακτηρίδια βρίσκονται σε συνδυασμό. Ο εμβολιασμός καλαμποκιού και γκαζόν με Α. brasilense και ΔΜΜ οδηγεί σε μια περιεκτικότητα σε Ν και P που είναι συγκρίσιμη με τα φυτά που καλλιεργούνται με λίπασμα. Ο συν-εμβολιασμός με διαφορετικούς τύπους ΔΜΜ είναι συνήθως πιο αποτελεσματικός λόγω της έλλειψης ειδικότητας για αποικισμό σε σχέση με τα είδη / τις ποικιλίες φυτών.

Η συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ δενδροειδών μυκορριζικών μυκήτων και μερικών ειδών PGPR, συμπεριλαμβανομένων των Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, και Pseudomonas, έχει επίσης δειχθεί ως επωφελής για την ανάπτυξη των φυτών. Ο βελτιωμένος αποικισμός των ριζών μέσω ΔΜΜ παρατηρείται όταν οι μυκορριζικοί μύκητες είναι συν-εμβολιαστεί με τέτοιο PGPR. Βρέθηκε τέσσερις φορές μεγαλύτερος αριθμός ριζών οζιδίων όταν τα φυτά εμβολιάστηκαν με ένα μίγμα που περιέχει Glomus deserticola και Rhizobium trifoli, σε σύγκριση με τον εμβολαισμό μόνο με R. trifoλι. Ενισχυμένη μυκόρίζα και σχηματισμός οζιδίων παρατηρείται γκαι κατά τον εμβολιασμό με συν-ενθυλακωμένα R. trifoli και Yarrowia lipolytica. Ο εμβολιασμός με Rhizobia και ΔΜΜ που σχηματίζουν οζίδια οδηγεί σε αύξηση, τόσο της αποτελεσματικότητας απορρόφησης φωσφόρου, όσο και αζώτου. Η εφαρμογή του PGPR ως εμπορικό βιολίπασμα που περιέχει κοινοπραξίες από διαφορετικά είδη μικροοργανισμών οδηγεί συχνά σε μια μείωση του βαθμού των λοιμώξεων, σε καλύτερη απορρόφηση των ανόργανων συστατικών και σε αυξημένη ανάπτυξη των φυτών. Όλα αυτά τα παραδείγματα είναι ενδεικτικά για την ευκολία και την υψηλότερη εφαρμοσιμότητα των βιολιπασμάτων που αποτελούνται από δύο ή περισσότερα είδη μικροοργανισμών που έχουν διαφορετιούς μηχανισμούς για την τόνωση της ανάπτυξης. Η δυνατότητα να δοκιμαστούν μερικά στελέχη PGPR και ΔΜΜ σε διάφορους τύπους καλλιεργειών και υπό διαφορετικές συνθήκες πεδίου θα πρέπει να επιτρέψει την επιλογή των κοινοπραξιών κατάλληλων για εμπορικούς σκοπούς.