Производство на инокуланти

Разработването на ефективен инокулант представлява многоетапна процедура, включваща прикрепването на един или повече щамове микроорганизми в определен носител, заедно с свързващи агенти и/или други добавки, които осигуряват защитата на клетките по време на съхранение и транспортиране. Тъй като инокуланти често се съхраняват при не-оптимални условия (например, висока температура, излагане на светлина), те трябва да имат удължен срок на съхранение, т.е. микроорганизмите трябва да бъдат жизнеспособни и да притежават способност да оцелява при неблагоприятни условия. Добрата формулировка също трябва да осигури ефективно интегриране на микроорганизмите в почвата и да засили тяхната активност, за да се извлекат максимални ползи след инокулирането на растенията гостоприемници. За да бъде лесно приет от фермерите, инокулантът трябва да бъде икономичен и лесен за работа и използване, за да гарантира, че микроорганизмите се доставят по най-адекватния начин и форма. Изготвянето на формулировката е решаващ въпрос, но за съжаление са проведени ограничени брой изследвания по този въпрос. Наличните данни показват, че от 80-те години на миналия век повечето изследвания върху Rhizobia са съсредоточени върху бактериалната генoмика и физиология и по-малко от 1% върху формулировъчните аспекти на инокулантите. При всички случаи има реална необходимост от подобряване на инокулантите, за да може да продължи ефективното разработване и комерсиализация на нови биоторове, които да бъдат по-успешни, по-стабилни във времето, с по-добро качество и да отговарят на всички други селскостопански нужди.

Идеална формулировка не съществува и очевидно всеки тип биотор има свои собствени предимства и ограничения. Съществуват обаче някои критични стъпки, които трябва да бъдат взети под особено внимание по време на производството на биоторове. Изборът, направен при тези стъпки, може да предреши успеха или неуспеха на инокулацията. Подборът на микроорганизмите, които трябва да бъдат инокулирани, е от решаващо значение. Някои от най-важните желани характеристики на инокулиращия щам (бактериален или гъбен) включват неговата генетична стабилност, способност му да бъде полезен за целевите култури, да бъде конкурентен на природните микробни популации, да мигрира от мястото на инокулация до растението гостоприемник и да е способен да оцелява при неблагоприятни условия в почвата без присъствието на гостоприемника. Други важни характеристики, които са от особено важно значение по време на производството, са способността на щама да се култивира в лабораторни условия (изключение правят АМГ, които не могат да се развиват без растение гостоприемник), възможността да расте или оцелява в носители (по време на концентриране или съхранение), върху семена и в почва, както и да бъде съвместими с агрохимичните продукти, които биха се използвали върху посевите. Живият инокулант също трябва да може да преодолее различните технологични процеси по време на производството и да запази своите функционални свойства. Бактериалните инокуланти обикновено се култивират в течна среда, за да се достигнат високи добиви от биомаса. Съставът на средата и условията на растеж (температура, рН, разбъркване, аериране и т.н.) са пряко свързани с физиологично-биохимичните свойства на конкретния щам и вида на инокуланта, който ще се произвежда. Получените бактериални култури се използват за инокулиране на разнообразни носители (капсулиране или импрегниране на торф и гранули) или след прибавянето на подходящи добавки да се получат активни течни формулировки. Мащабното производство на еднородни бактериални култури в биореактори, е много широко разпространена практика (Фиг.2).

Фиг.2. Масово производството на Azolla

Веднъж след като е избран специфичният щам/ове за инокулума, може да бъде дефинирана стандартизирана производствена процедура. Въпреки това, за биоторовете, за разлика от от биопестицидите, производствените разходи са сериозна бариера. Това се дължи на факта, че цената на биоторовете не трябва да надвишава тази на конвенционалните. Следователно, като растежна среда за РСРР, трябва да се използват евтини суровини (напр. суроватка, водни утайки, компост и др.). Друг подход за намаляване на производствените разходи е използването на агро-индустриални остатъци, обогатени със скален фосфат. По време на компостирането или ферментацията, свободните или имобилизирани микроорганизми, които произвеждат органични киселини, се добавят към матрицата, подобрявайки разтворимостта на фосфата и по този начин увеличават достъпа му до растенията.

Наскоро използването на биофилми също беше приложено като възможно средство за получаване на ефективни инокулуми. Биофилмът се състои от микробни клетки, вградени в полимерна матрица (известна като извънклетъчна полимерна субстанция ЕПС) и адхезирани към инертна или жива повърхност, която осигурява структура и защита на бактериалната култура. Три основни типа биофилми се наблюдават в почвата: бактериални (включително Actinomycetes), гъбни и гъбнo-бактериални. Както бактериалните, така и гъбните биофилми се формират на абиотични повърхности. Гъбните колонии влизат в ролята на биотична повърхност при сформирането на гъбно-бактериалните биофилми. Мнозинството от бактерии, намиращи се на корените и в почвата, образуват биофилми. Следователно, прилагането на РСРР щамове, които образуват биофилми, може да бъде успешна стратегия в разработването и производството на биоторове. Докато ектомикоризните гъби могат да бъдат произведени при ферментация, култивирането на инокуланти от арбускуларни микоризни гъби е много по-трудно поради необходимостта от растителен гостоприемник. Първите опити за производство на АМГ се основават на саксийни растения с почвени смеси или аеропоника. С развитието на моноксенните култури в края на 80-те години, става възможно производството на АМГ при строго контролирани условия. Разработени са методи за получаване на спори чрез използване на съвместно култивиране на петри (split-plate) и чрез трансформирани корени от моркови с Ri плазмидна ДНК на Agrobacterium. Методът позволява производството на средно около 15 000 спори в петри за период от 4-5 месеца след началото на производствения цикъл. Въпреки това, той се използва предимно за физиологични и лабораторни изследвания. Подобрения на този метод са постигнати чрез периодична смяна на средата в дисталното отделение на всеки втори месец, с паралелно допълване в проксималното отделение на глюкоза. Получените резултати водят до производството на около 65 000 спори след 7 месеца. Въпреки това, тези методи се използват главно за експериментално производство на спори или за поддържане на генни банки. Причината е, че средната годишна цена за производство на една спора достига до 30-50 USD, в зависимост от използвания метод. Мащабно ин витро производство на микоризни гъби, подходящо за прилагане в търговски мащаби, е разработено наскоро. Метода се основава на няколко ключови фактора: подбор на подходящи трансформирани корени от моркови с Ri плазмидна ДНК на Agrobacterium за различни АМГ видове, подбор и поддържане на оптимална среда за растеж и прилагане на процедури за осигуряване на качеството.

Въпреки това, търговски инокуланти, съдържащи видове АМГ, все още се произвеждат главно чрез отглеждане в растения гостоприемници при контролирани условия, с добавянето на различни гъбни структури (спори, мицел) и съдържащи остатъци от микоризни корени на растения, които се използват като посадъчен материал (като на пример сорго, царевица, лук, или Plantagolanceolata) (Фиг. 3). Това може да се счита за класически метод, при който субстрати от пясък / почва и / или други материали (напр. зеолит, перлит) се използват за масово производство на абурскуларен микоризен гъбен инокулум в саксии, торбички или легла за широкомащабни приложения. Критични елементи в тази производствена стратегия са:

1. използване на известни АМГ видове,
2. подбор на гостоприемници с кратък жизнен цикъл, адекватно развита коренна система, високо ниво на колонизация с голям набор от арбускуларни микоризни гъби и толерантност към относително ниски нива на фосфор,
3. контрол на нивото на минералните добавки в почвата,
4. подходяща комбинация от АМГ видове и растения гостоприемници.

С тази техника е възможно да се постигне плътност на инокулума от 80-100 хил. способни да прорастнат спори на литър. Това предполага необходимостта от разреждане на инокулума с носител за получаването на търговски продукт.

Фиг.3. Plantago lanceolate коренови нодули

Имайки предвид, че микробните асоциации между бактерии и микоризни гъби, които се срещат естествено в почвата, могат да стимулират симбиозата с растителните видове, вероятно формулировки, включващи два или повече вида различни PСРР, биха засилили благоприятния ефект върху растенията. Микробните консорциуми могат да стимулират растежа на растенията чрез набор от механизми, които подобряват усвояването на хранителни вещества и потискат гъбни патогени. Различните механизми, предложени да обяснят такова стимулиране на растежа, се основават на повишената скорост на циркулация на хранителните вещества. Последното се дължи на по-голямото съдържание на микроорганизми и богато биологичното разнообразие в почвата. Едновременното инокулиране с различни РСРР и / или АМГ често води до повишен растеж и добив, в сравнение с инокулиране с един вид, най-вече чрез подобряване на усвояването на хранителните вещества. Действително, взаимодействията между бактерии и арбускуларни микоризни гъби има позитивен ефект при усвояване на хранителните вещества, особено когато РСРР и N₂ –фиксиращи бактерии са в комбинация. Инокулиране на царевица и райграс с А. brasilense и АМГ води до съдържание на N и P сравними с растения, отглеждани с тор. Съвместното инокулиране с различни видове АМГ обикновено е по-ефективно, поради липсата на специфичност за колонизация по отношение на видовете/сортовете растения. Синергичното взаимодействие между арбускуларните микоризни гъби и няколко вида РСРР, включително Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, и Pseudomonas, също е доказано като благоприятно за растежа на растенията. Подобрена колонизация на корена чрез АМГ се наблюдава, когато микоризните гъби са ко-инокулирани с такъв РСРР. Четири пъти по-голям брой коренови нодули са открити, когато растенията се инокулират със смес, съдържаща Glomus deserticola и Rhizobium trifoli, в сравнение с единична R. trifoli инокулация. Засилена микориза и образуване на възли се наблюдава и при инокулиране с ко-капсулиран R. trifoli и Yarrowia lipolytica. Инокулирането с образуващи нодули Rhizobia и АМГ води до повишаване, както на ефективността на поглъщане на фосфор, така и на азот. Прилагането на РСРР като търговски биотор, съдържащ консорциуми от различни видове микроорганизми, често води до намаляване на степента на инфекции, по-добро усвояване на минерали и повишен растеж на растенията. Всички тези примери са показателни за удобството и по-високата приложимост на биоторовете, съставени от два или повече вида микроорганизми, имащи различни механизми за стимулиране на растежа. Възможността за изпитване на няколко щама РСРР и АМГ при различни видове култури и при различни полеви условия следва да позволи селекционирането на консорциуми, подходящи за търговски цели.